[COLOR=“Purple”][SIZE=“5”]تخطيط الأطباق Streak plating[/SIZE][/COLOR]
[COLOR=“Blue”][SIZE=“4”]عندما نضع المزارع البكتيرية علي سطح الأجار بواسطة أبرة التزريع ذات العقدة Loop أو منحنية الطرف bent-needle فإن هذا يسمي تخطيطا ً Streaking .
يمكن عمل الأطباق المخطوطة بأكثر من طريقة وهنا طريقتان مشروحتان ومصورتان وكلتا الطريقتين تعطيان نتائج ممتازة إذا أجريتا بدقة،وإن الهدف الأطباق المخطوطة هو الحصول علي معلق البكتريا المركز علي مستعمرات منفصلة تماما وعند التلقيح فإن الخلايا الكثيرة المتزاحمة الموجودة في بداية التخطيط تكون مستعمرات قريبة جدا من بعضها ولكن باستمرار التخطيط فإن أعداداً أقل فأقل تبقي بالقطيرات الموجودة علي أبرة التزريع .
طريقة التخطيط الأولي :
- عقم إبرة التزريع في اللهب حتى الاحمرار ثم أتركها لتبرد 20-30 ثانية .
- أغمس إبرة التزريع في المزرعة السائلة المراد التزريع منها أو ألمس touch أو أقطف المستعمرة Pick colony)) في حلة التزريع من طبق آخر.
- أبدأ بالتخطيط بادئا من الجهة البعيدة عنك في الطبق ثم سر بالإبرة في أتجاهك ملامسا سطح الأجار ذهابا وإيابا من حافة الي حافة مكونا خطوطا متوازية تبعد عن بعضها حوالي نصف سنتيمتر.
- عندما تصل الي منتصف الطبق لف الطبق 180 درجة واستمر في التخطيط متجها الي الجهة البعيدة عنك هذا التغير في الاتجاه لتجنب تعارض الإبرة مع حافة الطبق.
- غط الطبق بغطائه الممسوك بيدك الأخرى.
- حضن الطبق في درجة الحرارة المطلوبة لمدة 24 ساعة.
طريقة التخطيط الثاني : - عقم إبرة التزريع في اللهب حتى الاحمرار ثم أتركها لتبرد 20-30 ثانية ومن ثم اعمل خطين أو ثلاثة أو أربعه خطوط متوازية.
- عقم مرة أخري باللهب ثم أعمل خطوط عمودية علي الخطوط الأولي.
- عقم وكرر العملية وبهذا أنك تحقق نفس النتيجة الطريقة الأولي وهي تخفيف المزرعة.
- غط الطبق بغطائه الممسوك بيدك الأخرى.
- حضن الطبق في درجة الحرارة المطلوبة لمدة 24 ساعة.
يجب تحضين الأطباق وهي مقلوبة والغرض من ذلك تجنب تكاثف الماء علي الغطاء من الداخل ثم سقوطه علي المجاميع البكتيرية النامية فيسبب انتشارها وتداخلها مما يصعب عملية الفصل في أشكال المستعمرات.
[/SIZE][/COLOR]
[COLOR=“Purple”][SIZE=“5”]صبغ الكائنات الدقيقة [/SIZE][/COLOR]
[COLOR=“Blue”][SIZE=“4”]البكتريا الحية عديمة اللون تقريبا وتباينها مع الوسط المائي المعلقة به لا يكفي لويتها بوضوح فلذلك فإن الصبغ البكتيريا يجهلها تتباين Contrast في اللون عن الوسط الموجودة به فتصبح مرئية ويسهل تمييزها وبالإضافة الي ذلك فإنه كي تستخدم العدسة الزيتية في الفحص للوصول الي أكبر درجة من التكبير فإنه من الأنسب استعمال الصبغ البكتيري.
طريقة العمل procedure
1.تحضير وتثبيت التحضير البكتيري للصبغ :
قبل إجراء عملية الصبغ عليك أن تثبت المادة التي ستفحصها، بمعني أن تلصق المادة بسطح الشريحة التي ستصبغ عليها ، وإذا لم يتم تثبيت التحضير فإن غشاء الخلايا سيزول من علي الشريحة أثناء عملية الصبغ . - ضع قطرة ماء نظيفة في وسط الشريحة
- بواسطة الإبرة ذات العقدة خذ مستعمرة بكترية وأمزجها مع قطرة الماء جيدا.
- أنشر بالإبرة مزيج المزرعة الصلبة (أو غمسه المزرعة السائلة) علي مساحة 1سم2 لتكون غشاءا رقيقا thin film ومعظم المتدربين يقعون في خطأ تحضير غشاء سميك.
- أترك الشريحة لتجف في الهواء أو أمسك الشريحة أعلي اللهب بحوالي 20 سم بحيث لا يغلي الغشاء الموجود علي الشريحة.
- بعد ذلك ثبت الغشاء المتكون بتمرير الشريحة في اللهب ثلاث مرات مراعيا وجود الغشاء في الأعلى ويراعي في هذه الخطوة أن استعمال الحرارة أكثر من اللازم سيشوه شكل وتركيب الخلية المصبوغة لذا يجب أن تكون الشريحة دافئة وليست ساخنة ويعرف ذلك أذا وضعت الشريحة علي ظهر اليد.
- الصبغ بواسطة صبغة جرام :
- ضع الشريحة التي عليها الغشاء الذي سبق تحضيرها علي الحامل المخصص للصبغ .
- أغمر الغشاء حوالي 5 نقط من صبغة الميثلين الأزرق لمدة 30-60 ثانية
- أغسل بالماء.
- غط الشريحة بمحلول اليود وأتركه لمدة 30 ثانية للتفاعل.
- أغسل بالماء.
- ضف كحول 95% لإزالة اللون، الغشاء الرقيق يكفيه من 10-20 ثانية مع إمالة الشريحة.
- أغسل بالماء.
- اصبغ بالصبغة المضادة وهي الصفرانين لمدة 30 ثانية
- أغسل بالماء ومن ثم جفف الشريحة بورقة التنشيف أو اتركها تجف بالهواء.
- أفحص بالعدسة الزيتية.
الاختبارات البيوكيميائية
كثيرة هي الاختبارات البيوكيميائية لكننا سنتناول بشئ من الاختصار الشديد تلك التي نجريها في المختبر في شكل خطوط عريضة بينما نتناولها كاملة في الشرح أثناء التدريب والتي لابد أن يتعرض لها المدرب المسئول بشئ من التفصيل.
لقد ساعدت الاختبارات البيوكيميائية كثيرا في التفريق بين أنواع البكتريا المختلفة وتجري هذه الاختبارات بعد نمو الميكروب علي الوسط فيتم عزل مستعمرة نقية وملاحظة التفاعل الكيميائي الذي قد ينتج عنة إنزيم أو يتغير لون المؤشر Indicator ومن هذه الاختبارات اختبار IMVic test
وApi20 والذي تستخدم علي مدي واسع في العالم للتفريق بين أنواع البكتريا المعوية الجدول التالي يوضح اختبار IMVic والتفاعل الكيميائي الذي يحدث والتفاعل البيوكيمائي الناتج.
جدول يفصل أهمية اختبار IMVic test.
الاختبار
الاستعمال الرئيسي
التفاعل البيوكيمائي
الاختبار الايجابي
أندول Indol
للتفريق بين البكتريا العصوية السالبة الجرام خاصة E.coli
يتكسر التربتوفان مع تحرر الإندول
يتحول الوسط أو المؤشر الي اللون الأحمر
احمر الميثيل
Methyl red
للتفريق بين البكتريا المعوية
يقوم الكائن بتخمر الجلوكوز ويتغير لون الوسط
وسط أحمر فاتح
فوجس بروسكاور Voges Proskauer
للتفريق بين البكتريا المعوية
يقوم الكائن بتخمر الجلوكوز مع إنتاج الـ acetoin
لون بنفسجي يكون ببطء في الوسط
الســـــيتريز citrase
للتفريق بين البكتريا المعوية
تستعمل البكتريا السترات كمصدر وحيد للكربون ويغير اللون
يتحول الوسط الي أزرق معكر.
oman"’> حضن الطبق في درجة الحرارة المطلوبة لمدة 24 ساعة.
يجب الالتزام والعمل بهذه الإرشادات لضمان جودة العمل داخل المختبر والسلامة الشخصية لأفراد المختبر ولتعم الفائدة قمنا بكتابة هذه الإرشادات باللغة الإنجليزية بصوره أكثر وضوحا وشمولية والإرشادات هي:
- اعتبار وجود خطر كامن في جميع المواد الكيميائية والأوساط الغذائية ويجب التعامل معها حسب توصيات الصانعين
- الالتزام بارتداء المعطف (lab coat ( والأقنعة الواقية والقفازات أثناء العمل ويجب تركه دائما في المختبر وعدم أخذه إلي أماكن تناول الطعام أو مكان السكن.
- يجب عدم الأكل أو الشرب داخل المختبر أو وضع مأكولات أو مشروبات في ثلاجة المعمل.
- يجب عدم استخدام الفم أو لمس العينين أثناء العمل داخل المختبر.
- أتبع الاسلوب السليم في التخلص من أي مواد (حيوية أو كيمائية).
- يجب تطهير وتنظيف مكان أجراء التحاليل المعملية بمطهر قبل وبعد أجراء التحاليل.
- يجب توضيح أسماء وأرقام العينات بشكل واضح علي الأطباق قبل إدخالها الحضانات Incubators) (.
- يجب التعامل مع المنابت المحتوية علي الميكروبات بحرص وعدم حملها خارج المختبر.
- في حالة استخدام القفازات الواقية يجب الامتناع كلية عن لمس كافة محتويات المختبر حتى لا تتلوث وتصبح مصدرا للعدوى.
- غسل اليدين جيدا بالماء والصابون ومسحها بالمطهر قبل مغادرة المختبر.
الأجهزة والمتطلبات Materials & Requires
قد تتباين المختبرات في تجهيزاتها ويعتمد ذلك علي حجم العمل المطلوب وهدفه ولكن هنالك معدات أساسيه يجب توفرها في جميع مختبرات الأحياء الدقيقة وهي: - حضانات Incubators
- جهاز تعقيم Auto calve
- فرن الهواء الساخن Hot air oven
- جهاز عد المستعمرات البكترية Colony counter
- كيمياويات مختلفة (أوساط غذائية- محاليل)
- الكابينة الواقية Safety Cabinet
- جهاز حمام مائي water bath
- مجهر Microscope
- مبردات ومجمدات Refrigerators &freezers
- مرطمان لاحيهوائي An aerobic jar
- جهاز هضم العينات Stomacher
- موقد بنزن Bunsen burner
- جهاز الطرد المركزي Centrifuge
- زجاجات مختلفة Glass ware (أطباق- أنابيب- ماصات –الخ…)
يجب عند استلام العينات مرعاه مايلي :
· أن تسجل جميع البيانات المدونة علي البطاقة (الاسم التجاري، تاريخ الصلاحية،بلد المنشأ الخ…)
· أن ترفق مع العينة نسخة من تقرير أخذ العينة وتغلق رسميا.
· أن يجري الفحص الظاهري علي عبوات العينات لتبين أي عيوب طبيعية.
· أن تفحص الأكياس البلاستيكية والقوارير بعناية للتأكد من عدم وجود تمزق أو ثقوب.
· أن تسجل درجة حرارة العينة إذا كانت سريعة التلف وغير مجمدة.
· أن تكون العينات المجمدة في حالة متجمدة حين استلامها في المختبر.
· أن تجري الاختبارات علي العينة فور وصولها للمختبر وفي حالة تعذر ذلك تخزن العينات. المجمدة عند درجة حرارة (-18)°س حتى وقت الاختبار علي ألا تؤجل أكثر من 24 ساعة.
· أن تخزن العينات غير المجمدة سريعة التلف عند درجة حرارة تتراوح بين صفر الي 5° س بحيث لا تزيد مدة التخزين علي 24 ساعة.
· أن تخزن العينات غير سريعة التلف والمعلبة أو الأغذية منخفضة الرطوبة عند درجة الغرفة حتى وقت الاختبار.
إعداد العينة :
العينات السائلة :
ترج العينة السائلة غير اللزجة التي يمكن أخذها باستخدام الماصة أو التي يكون توزيع الكائنات الدقيقة فيها متجانسا عن طريق تحريكها 25 مرة في الاتجاه الأعلى والأسفل في مدي حوالي 30 سم لمدة 7 ثوان وفي حالة استخدام جهز رج ميكانيكي ترج العينات لمدة 15 ثانية.
العينات في شكل مسحوق:
تخلط العينة جيدا باستخدام ملعقة معقمة أو ملعقة أخذ العينات حتى تصبح العينة متجانسة.
العينات الصلبة:
تؤخذ عينة ممثلة باستخدام أداة مناسبة لذلك.
العينات المجمدة:
ترفع درجه حرارة العينات المجمدة لإزالة تجمدها في عبواتها الأصلية أو في الوعاء الذي تم استلامها فيه في المختبر مع تفادي نقل العينة بقدر الإمكان الي وعاء آخر، وترفع درجة حرارة العينة الي 2 ° الي 5° وفي حالة الرغبة في الإسراع في عملية التسييح ترفع درجه حرارة العينات الي درجة أقل من 45°س لمدة لا تزيد علي 15 دقيقة .
عند رفع درجة الحرارة العينة المجمدة الي درجة الحرارة العادية تحرك العينة بحركة ترددية ويفضل أن يكون ذلك بصورة مستمرة.
ملحوظة :
في حالة العينات التي يمكن تداولها بسهولة وهي مجمدة كالآيس كريم فلا داع الي إزالة تجميدها
العينات المعلبة :
· تنزع البطاقة من العبوة وتفحص العلب لملاحظة أي عيوب خارجية وتدون الملاحظات.
· يغمر الجزء العلوي بمحلول مطهر ومن ثم يجفف بواسطة قطن صوفي معقم .
· يمرر اللهب فوق سطح العبوة ويجب ألا تعرض أي عبوة منتفخة للهب(يراعي أن يكون الجزء القفل الجانبي للعبوة في اتجاه بعيد وجه القائم بالتحليل.
· يثقب السطح العلوي المعقم من غطاء العبوة باستخدام أداة معقمة ثم يوسع الثقب بحيث يكون قطرة 2.5 سم ثم يغطي بطبق بتري معقم.
· في حالة العلبة المزودة بغطاء سهل الفتح تفتح العبوة من الجهة الأخرى مع مراعاة عدم التأثير علي الغطاء سهل الفتح.
العينات المعبأة في الأكياس:
· ينظف ويطهر الكيس بمحلول مطهر ثم يجفف جيدا باستخدام منشفة معقمة.
· تقطع نهاية الكيس أسفل مكان القفل باستخدام مقص معقم وفي حالة الأكياس الكبيرة يمكن عمل فتحة بمقدار 5 سم الي 7.5 سم وذلك عن طريق القطع في لركن العبوة في اتجاه مائل ثم يفتح الكيس مع مراعاة عدم لمس نهاية الكيس.
عينات المياه المختلفة:
· عند سحب عينات من مياه شبكة أو مياه معالجة يجب استعمال زجاحيات معقمه وفي حاله المياه المعالجة بالكلور يجب أضافه 0.1 مل من محلول هايدروكسيدي لمعادلة الكلور الذي قد يقوم بقتل ماتبقي من البكتريا الحية المراد كشفها أثناء نقل العينة الي المختبر؟
· في مثل هذه العينات يتوجب وضع العينات في حافظه مبرده علي أن تصل الي المختبر في غضون ساعتين علي الأقل ذلك لضمان وصول الميكروبات حيه الي المختبر ومن ثم اجراء التحاليل المطلوبة مثل اختبار ال Coliform.
� الذي تم استلامها فيه في المختبر مع تفادي نقل العينة بقدر الإمكان الي وعاء آخر، وترفع درجة حرارة العينة الي 2 ° الي 5° وفي حالة الرغبة في الإسراع في عملية التسييح ترفع درجه حرارة العينات الي درجة أقل من 45°س لمدة لا تزيد علي 15 دقيقة .
Manual LAB
ينقسم العمل في مختبر الأحياء الدقيقة إلي ثلاث محاور هامة يعتمد كل منهما علي الآخر في إنجاح العمل داخل المختبر وهي:
-
تحضير الأوساط الغذائية Preparation Of media
-
التعقيم Sterilized
-
التزريع Culturing
تحضير الأوساط الغذائية Preparation Of media
ابُتدعت طريقة لتنمية البكتريا علي منابت (بيئات مزرعية-(Culture media اصطناعية وهذه البيئات المزرعية ليست متماثلة تماما مع البيئة الاعتيادية التي تعيش فيها البكتريا إلا أنه روعي في تكوينها الاحتياجات والمتطلبات الغذائية اللازمة لنمو الأجناس المختلفة من البكتريا وبما لا يؤثر في خواصها المورفولوجية والبيولوجية.
تزرع البكتيريا علي المنابت لأغراض كثيرة أهمها :
· الحصول علي نوع واحد من البكتريا (Single species) في هيئة مستعمرة بكتريـة نقية (Pure colony).
· الحفاظ علي البكتريا داخل المختبرات لفترة طويلة قد تصل لسنوات .
· للتعرف علي أشكالها وخواصها المختلفة وأعدادها المحتمل وجودها في المـنتج
( Plate count).
أنواع الأوساط المزرعية : -
أوساط صلبه Solid media:
وهي تصب في الأطباق أو الأنابيب ثم تترك حتى تجمد ومن ثم يتم التزريع وتستخدم في أغلب الأحيان لعزل البكتريا ومعرفة خواص النمو وتستخدم أبرة التزريع ذات العقدة wire loop في التخطيط. -
أوساط نصف صلبه Semi solid media:
وهذه تصب في الأنابيب ومن خواصها أنها نصف صلبة ويتم عن خلالها التعرف عن خواص البكتريا من حيث الحركة في اختبار الحركة motility test . -
أوساط سائله Liquid media: وهي أوساط تساعد كثير في أنماء البكتريا وتعمل البعض منها في تنشيط النمو البكتيري والبعض الآخر يستخدم في تثبيط النمو وعزل مجموعة بكترية عن أخرى.
طريقة التحضير Preparation Of media method :
Ø يتم وزن الوسط المراد تحضيره بميزان حساسSensitive balance) ) وحسب إرشادات الـوصف Directions الموجودة علي علبة الوسط المغذي وهي تختلف من شركة إلي أخري فمثلا شركة Oxoid يختلف فيها عدد تحضير جرامات peptone water عن شركة Mast الإنجليزية.
Ø إضافة الماء المقطر distilled water الي الوسط الذي تم وزنه ومزجه جيدا بتحريك الدورق flask)) عدة مرات بغرض التذويب الأولي للوسط.
Ø إذابة الوسط بواسطة التذويب باللهب flame ويفضل التذويب بالحمام المائي Water bath لأن حرارة اللهب الشديدة قد تؤدي ضرر يلحق ببعض مكونات الوسط لذا عند استعمال اللهب المباشر يوضع جهاز قياس حراري لمتابعة درجة حرارة الوسط وتحريك الدورق بين الحين والآخر لضمان عدم احتراق الوسط.
Ø بعد التذويب يحول الوسط الي جهاز التعقيم المسمي بالضغط البخاري(الأتوكلاف (Autoclave
Ø يجب مراجعه إرشادات الوسط الخاص بدرجة التعقيم فهي تختلف من وسط إلي آخر فهنالك أوساط لا تعقم بالأتوكلاف Do no autoclave.
Ø حفظ الوسط في مكان مظلم وبارد في حالة عدم استخدامه وذلك للحفاظ علي مكوناته وعند صبة في الأطباق يجب استخدامه مابين 2-5 أيام علي الأقل.
Ø مراجعة وضبط الأس الهيدروجيني للوسط قبل التعقيم وذلك لضبط تأثير البيئة والحصول علي النمو الأمثل للبكتريا وتكون قراءه الأس الهيدروجيني عند درجة °C25 ويتم ضبط حمضية وقلوية الوسط بإضافة 1N-NaOH أو 1N-HCl
Ø يجب تغطية الأنابيب بالقطن أو السدادة دائما قبل إدخالها إلي جهاز التعقيم .
[/SIZE][/COLOR]
[COLOR=“Blue”][SIZE=“4”]أهم الوسائل الفيزيائية المستخدمة في عملية التعقيم ما يلي :
الحرارة Heat تستخدم الحرارة في تطبيقات مختلفة في التعقيم وذلك في صورتين :
· الحرارة الرطبة Moist heat وهي عبارة عن استخدام بخار الماء الساخن وهي أفضل الطرق المستخدمة في التعقيم ومثال لذلك استخدام جهاز Autoclave .
· الحرارة الجافة Dry heat وهي استخدام الهواء الساخن ومتمثلة في جهاز Oven والتعقيم باللهب المباشر.
Ø يجب في التعقيم بجهاز autoclave مرعاه زمن ومدة التعقيم وألا يتجاوز المدة والحرارة المعروفة علي حسب كل وسط وما هو موجود في وصف تحضير الوسط Directions .
Ø يجب مراجعة الماء الموجود داخل جهاز autoclave لأن قلة الماء ستؤدي الي تعرض الوسط الي حرارة جافة بدلا من الرطبة التي يفرها بخار الماء.
التزريع Culturing:
القصد من عملية زراعة البكتريا في المختبر هو الحصول علي مستعمرة بكترية نقية ((Pure colony للتعرف علي الميكروب النامي كما ذكرنا في أغراض تحضير الأوساط الغذائية ولذلك لابد من أن نكون قادرين علي تعقيم البيئة والاحتفاظ بها في صورة معقمة ودون حدوث أي تلوث من الخارج.
هنالك إرشادات يجب الإلزام بها من مسئول المختبر الي المتدربين معه في المختبر وقد تم ذكرها سالفا إضافة إلي بعض التوجيهات وهي :
· الامتناع عن الحديث أثناء عملية التزريع لتلافي حصول تلوث من رزاز الفم .
· كتابة تاريخ دخول العينة والاختبارات المطلوبة لها.
· التأكد من كتابة رقم العينة علي الطبق((Plate أو الأنبوب ( (Tubeبوضوح شديد،وفي بعض المختبرات يلزم المحلل بكتابة أسمه وأسم العينة ودرجة التحضين.
- Be sure to label the bottom of your plate with your name(s), date, temperature of incubation, and specimen
· تسجيل النتائج التي تم الحصول عليها في دفتر العينات مع ذكر التاريخ وإمضاء المحلل الذي قام بإجراء التحاليل.
· التخلص الفوري من الأطباق التي تمت قراءتها ثم تدوين نتائجها بإرسالها إلي غرفة التعقيم وإبادتها لمنع أي تلوث قد تتسبب فيه الميكروبات النامية علي تلك المزارع.
· التزريع وفتح المستنبتات البكترية دوما يكون بالقرب من اللهب منعا لتلوث الوسط الغذائي ولسلامة المحلل من الإصابة ببعض الميكروبات الممرضة النامية علي المستنبت.
يقوم مختبر الأحياء الدقيقة بالهيئة بالكشف علي كثير من أنواع البكتريا التي تقوم بالتسبب في التسمم الغذائي Food poisoning في المنتجات والسلع المختلفة في الوقت الراهن ،
حيث تسعي الهيئة في تطوير قسم الأحياء الدقيقة وإدخال آخر التقنيات الحديثة وتحت إشراف خبراء أجانب إضافة إلي توسيع القسم بإنشاء مختبر حديث وهو مختبر الأحياء الدقيقة الطبية Medical Microbiology Lab لأجراء التحاليل الميكروبيولوجية الطبية التي تتمثل في التأكد من سلامة المحاليل الوريدية ومستلزمات المرضي المختلفة مدة التعقيم وألا يتجاوز المدة والحرارة المعروفة علي حسب كل وسط وما هو موجود في وصف تحضير الوسط Directions .
Ø يجب مراجعة الماء الموجود داخل جهاز autoclave لأن قلة الماء ستؤدي الي تعرض الوسط الي حرارة جافة بدلا من الرطبة التي يفرها بخار الماء.
التي تتطلب أن تكون ذات تعقيم عالي وخالية من الميكروبات مثل( الضمادات الطبية التي توضع علي العين)، والأهم من ذلك هو إدخال جهاز الـ PCR الذي يختص بالوراثة الجزئية حيث يتم التعرف علي الميكروب عن طريق الحمض النووي الخاص به (DNA) في ساعات قليلة.
الاختبارات المعملية :
الاختبارات والتحاليل التي يجريها المختبر تكون كلها ضمن المواصفة السودانية التي تحدد مسار الاختبار والحدود المايكروبيولوجية لكل منتج فالحليب المجفف مثلا لديه خمس تحاليل والسمك والقشريات تحليلين فقط وعلي كل حال التحاليل تشمل الكشف عن :
- العد الكلي للبكتريا الهوائية Aerobic Plate Count (APC)
- مجموعة القولون Coliform group
- بكتريا السالمونيلا Salmonella Sp
- العد الكلي للفطريات والخمائر Mould & Yeast Count
- بكتريا الإشريشيا كولاي E.coli
- بكتريا الإستافيلوكوكس Staphylococcus aureus
- بكتريا الكلوستدرديوم بيرفرنجس Clostridium perferngnes
- بكتريا الليستريا مونوسايتوجنس Listeria monocytognes
- بكتريا الغلال Bacillus cereus
- بكتريا الكلوستدرديوم بولتينيوم bolotinum Clostridium
- بكتريا الكوليرا Vibrio parahaemolyticus
- بكتريا حمض اللاكتيك Lactobacillus Sp
anguage:EN-US;mso-fareast-language:EN-US;mso-bidi-language:AR-SA’> لأجراء التحاليل الميكروبيولوجية الطبية التي تتمثل في التأكد من سلامة المحاليل الوريدية ومستلزمات المرضي المختلفة مدة التعقيم وألا يتجاوز المدة والحرارة المعروفة علي حسب كل وسط وما هو موجود في وصف تحضير الوسط Directions .
Ø يجب مراجعة الماء الموجود داخل جهاز autoclave لأن قلة الماء ستؤدي الي تعرض الوسط الي حرارة جافة بدلا من الرطبة التي يفرها بخار الماء.
التخفيف التسلسلي Serial Dilution
يعتبر عزل البكتريا من العينات من أهم الطرق المتبعة لتشخيص الأمراض البكترية ويكون ذلك بزرعها علي المستنبتات المناسبة والتخفيف التسلسلي يعتبر ذات أهمية كبري حيث أن كثير من العينات لابد من تخفيفها قبل البدء في زراعتها علي البيئات الغذائية وللحصول علي عدد الخلايا لابد بالضرب علي مقلوب التخفيف، ونستخدم وسط Peptone water للتخفيف لمميزاته الخاصة كوسط مغذي Enrichment Broth وقدرته علي الاحتفاظ بالبكتريا حية لفترة طويلة عكس المحلول الملحي المعقم Normal saline أو الماء المقطر المعقم الذي لا يحتفظ بالمجاميع البكترية لفترات طويلة، وذلك بالطبع لأن المكونات في المحلول الملحي أو الماء المعقم ليس بالتي توفر المواد اللازمة للعيش لساعات طويلة والمحاور التالية توضح خطوات التخفيف التسلسلي:
- يتم وزن 25 جرام من العينة وتضاف الي التخفيف الأول -110 قدرة 255 مل في حاله أختبار السلمونيلا ويتم تحريكها أو 50 جرام الي 450 مل وهزها جيدا عدة مرات لضمان تجانس العينة مع الوسط المخفف.
- يتم نقل 10 مل من التخفيف الأول الي التخفيف الثاني الذي حجمه 90 مل.
- يتم نقل 2 مل من التخفيف الثاني الي التخفيف الثالث الذي حجمه18 مل.
- يتم نقل 1 مل من التخفيف الثالث الي التخفيف الرابع الذي حجمه 9 مل.
- ويمكن الاستمرار في التخفيفات بعد ذلك حسب متطلبات العمل.
الرسم التالي يوضح كيفية التخفيف التسلسلي باستخدام ماء معقم في عينة مقدارها واحد جرام
وهي من التحاليل الهامة تستخدم لمعرفة الأعداد البكترية الموجودة في العينة أو المنتج وبالتالي معرفة مدي جودة المنتج وخصوصا في المنتجات الغذائية، فهو مؤشر واضح في حالات الأغذية المتلوثة بالبكتريا أن المنتج لم يتم معاملته جيدا في المصانع أو في حالة الألبان المبسترة عندما يكون مثلا عدد المستعمرات البكتريا أكثر من 104 لكل خلية/ملي للتر.
ويستخدم فيها وسط t Nutrient Agar أو Plate count agar أو Plate standard agar
وتعتبر من الأوساط التي العامة (General Media) التي تنمو عليها معظم أنواع البكتريا وهي كذلك وسط جيد للنمو كما تستخدم في أغراض التقدير الكمي لتعداد المستعمرات البكترية.
لدينا أكثر من طريقة للعد ولكلٍ خاصيتها وميزتها ومثال لذلك:
· Pour plate count(PPC):
وهي طريقة صب الأطباق وفيها ينقل واحد مل من العينة المخففة الي الطبق ومن ثم تضاف20-15 مل
من Agar Nutrient أو Plate count agar وهي في درجة حرارة C45 ثم تترك تجف وبعد ذلك تخلط مع العينة بواسطة التحريك أو الهز الخفيف للطبق ثم يترك ليتصلب الوسط ويتم تحضينها في درجة حرارة C 37 لمدة 48 ساعة ومن ثم تعد الأطباق التي نمت عليها المستعمرات، ومن القواعد المتبعة للعد هي اختيار الأطباق التي تحوي بين (25-250) مستعمرة فمثلا إذا كان التخفيف في الطبق الأول يحوي 20 مستعمرة فإنا لا نقوم بعملية العد لأنها أقل من 25 مستعمرة وكذلك حينما نجد أن التخفيف الأول أو أي تخفيف أكثر من 250 مستعمرة لا نقوم بعد هذا الطبق وإنما نذهب للتخفيف الذي بعدة وهكذا ، والقاعدة الثانية قانون عدد الخلايا البكتيرية …
عدد الخلايا البكترية مل/لتر = عدد المستعمرات × مقلوب التخفيف
فإذا كان عدد المستعمرات في التخفيف الرابع 80 مستعمره فإن العدد الكلي = 80× 104
· Spread plate count(SPC):
وهي الطريقة الثانية من طرق العد الكمي للبكتريا وتختلف في أن يتم صب الأطباق بالوسط المغذي ثم يترك ليجف ومن ثم يسحب 0.5 مل من التخفيف بالماصة وينشر بواسطة قضيب زجاجي were glass بسرعة، وهذه الطريقة تختلف عن الأولي بأن نسبة الكثافة البكترية أقل ويرجع ذلك لأن توزيع التخفيف يكون علي السطح فقط بينما الأخرى يكون التخفيف or:maroon’>Ø يجب مراجعة الماء الموجود داخل جهاز autoclave لأن قلة الماء ستؤدي الي تعرض الوسط الي حرارة جافة بدلا من الرطبة التي يفرها بخار الماء.
تمازجت وانتشرت بصورة واسعة في سطح وأسفل الوسط مما يعطي نتائج حقائق العدد البكتيري ولذلك تفضل الطريقة الأولي Plate count.
· Plate loop count (PLC)
وهذه هي الطريقة الثالثة التي تستخدم في العد البكتيري للمستعمرات وإن كانت هي الطريقة الأقل استعمالا في المختبر وتتم عن استخدام إبرة التزريع بدلا عن الماصة في النقل بدلا عن الماصة من محاسن هذه الطريقة يمكن تزر يع عدد من العينات ومن المساوئ لهذه الطريقة أن التخفيف غير منتظم أو غير دقيق بمعني أن عدد المستعمرات في الإطباق غير مدرج بترتيب تنازلي فالتخفيف الأول والثاني والثالث في كثير من الأحيان يكون الفرق غير محسوس والرسوم التوضيحية قد تشرح ذلك جيدا.
Membrane filtration (MF):
وهي الطريقة الرابعة التي تستخدم في العد البكتيري للمستعمرات وفيها تستخدم عينة سائلة أو شبه سائلة liquid or semi-liquid samples مثال لذلك (الماء – العصائر- الألبان ) وورقة ترشيح وبعض المتطلبات الأخرى .
وعموما هي أكثر استخداما لعد مجموعة الكوليفورم أو بكتريا الأستافيلوكوكس، ويستخدم في هذه الطريقة فلتر ترشيح خاص ودقيق يبلغ حجم مسامه 0.45 µm بحيث يسمح بنفاذية العينة ويمنع البكتريا ويبقي البكتريا علي ورقة الترشيح ويتم وضعها علي طبق بتري علية وسط مغذي ويحضن لمدة 18-24 ساعة في درجة 37 ومن مميزات هذه الطريقة أن حجم العينة المستخدمة 25 مل وهي نسبة كبيرة قياسا بالطرق الأخرى حيث يستخدم 1 مل أو0.1 مل وهذا جيد من الناحية العملية إذ الحجم يعبر عن العينة بشكل جيد وكذلك من ناحية زمن التحضين وهذا ملخص عن الطرق المختلفة للعد البكتيري للمستعمرات.
2. مجموعة القولون Coliform group :
تعتبر عائلة البكتريا المعوية Enterobacteriaceae من الكائنات الدقيقة التي توجد في أمعاء الإنسان والحيوان وتتكون من أعداد كبيرة ومتباينة وهي عصوية سالبة لصبغة جرام وتشمل هذه العائلة أعداد كبيرة من أجناس البكتريا مثل E.coli ,Salmonella, Shigella Klebsiella,proteus,Enterobacter,Serratia وهذه الكائنات الموجودة طبيعيا في الأمعاء ولكنها تسبب في كثير من الأحيان أمراضا للإنسان، أما البعض الآخر مثل Salmonellae و Shigellae فهي من الميكروبات المرضية الهامة ولهذا فإن التعرف السريع والدقيق لهذه الميكروبات ضروري للعلاج السليم للأمراض التي تسببها
وتنتج هذه العائلة الكثير من السموم وهي تسمي بالعصويات السالبة لصبغة جرام أو
( البكتريا المعوية) أو (الكوليفورم) والطريقة التقليدية للتعرف عليها تتم باستخدام سلسلة من اختبارات تخمر السكريات واختبارات بيوكيميائية تتم في أنابيب بيئات، سيتم ذكرها تباعا بقليل من الاختصار.
للكشف عن هذه المجموعة يتم التزريع في وسط MacConkey ويحتوي علي بعض المواد
الكربوهيدرتيه والتي يفرق بها بين مخمرات اللاكتوزLactose-fermentation وغير مخمرات اللاكتوز Lactose fermentation Non والتي توضح التعرف الأفتراضى عن وجود البكتريا المعوية ويكون التخمر واضحا بتغير الوسط MacConkey broth وتحول اللون الي الأصفر وعند استخدام أنبوب درهام Durham tube يلاحظ وجود الغاز من عدمة لأن وجود الغاز يؤكد افتراضية وجود Coliform ويستخدم وسط آخر يسمي Lauryl tryptose broth ويتم الكشف عن وجود الـ Coliformبواسطة الغاز المتجمع في أنبوب درهام ويتم التحضين لمدة 48 ساعة في درجة C37 ويتم بعد ذلك حساب مجموعة بكتريا �رطبة التي يفرها بخار الماء.
القولون بواسطة طريقة العدد الاحتمالي The Most probable Number (MPN) للأنابيب الموجبة وهي أن تقوم بحساب الأنبوب الذي تجمع فيه الغاز من كل تخفيف علي حدي مثال أن لدي ثلاث تخفيفات ولكل تخفيف يتم التزريع في ثلاث أنابيب أو خمس علي حسب العمل المطلوب لديك، نتيجة التخفيف الأول كانت الثلاث أنابيب موجبة أي وجود غاز وتخمر والثاني والثالث أنبوبين وبالرجوع إلي جدول طريقة العدد الاحتمالي يتم استخراج النتيجة كما هو موضح في الشرح التفصيلي الموضح في الأسفل
طريقة عد بكتريا الكلورفوم بواسطة الأطباق :
وفيها تسختدم وسط VRB)) Violet Red Broth ويتم التزريع بنقل 0.1 مل من التخفيفات المختلفة والتحضين في درجة 37 لمدة 24 ساعة ومن قراءه النتائج وذلك بمشاهدة مستعمرات وردية اللون الي أحمر فاتح . ويتم عدها بطريقة قانون عد البكتريا المعروف.
بكتريـا
**هي من مجموعة بكتريا القولون التي تعيش فيه بصورة طبيعية ومع ذلك وتعتبر E.coli من أكثر أنواع العائلة المعوية وجودا في كائنات الأعداء وتكون البكتريا ممرضة فقط عند وصولها الي الأنسجة خارج منطقة تواجدها الطبيعية في الأمعاء
· تعتبر البكتريا المعوية السامة من نوع E.coli مسئولة من معظم الاسهالات التي تحدث أثناء السفر أو تناول الأطعمة الملوثة حيث تنتج بعض الأنواع سموم خارجية Exeo toxins .
· إصابة الجهاز البولي Urinary Tract Infection (UTI) حيث تعتبر من أكثر الأنواع التي تسبب إصابات الجهاز البولي حيث نجد أن 90% من الإصابات الأولية لهذا الجهاز في النساء صغار السن ومعظم هذة الإصابات تسببها E.coli ذات المولد المضادO)) Antigen (O) أما التي تحتوي علي أنتجين (K) فهي التي تتسبب في إصابة الجزء العلوي من الجهاز البولي.
· تسبب في تسمم الدمSepsis عند وصولها إلي مجري الدم خاصة عندما تكون أجهزة المقاومة للعائل ضعيفة وغير كافية.
· تعتبر الـ E.coli والمجموعة B من السبحيات Streptococcus SP من الأنواع المعروفة في أحداث الالتهاب السحائي في الأطفال وهي تتسبب في حوالي 40% من حالات السحائي مع الولادة الحديثة ( neonatal meningitis) .
طريقة التحليل :
يتم الكشف عن E.coli من الأنابيب الموجبة في مجموعة الـ Coliform حيث يتم نقل واحد مل منها بالماصة أو عن طرق إبرة التزريع إلي وسط brilliant green broth ويستخدم في أنبوب درهام للكشف عن إنتاج غاز لمدة 18-24 ساعة في درجة حرارة ° c44-45 وهي الدرجة المثلي لنمو E.coli حيث يقل نمو الأخريات عندها ومن ثم التزريع في وسط EMB أو أوساط MacConkey’s ومشاهدة نمو المستعمرات بعد 24 ساعة في درجة تحضين 37 يلاحظ تخمر اللاكتوز وتكون مستعمرات محدبة ذات سطح معدني لامع Metalic Sheen) ) علي أوساط التزريع.
قد يشاهد علي هذه الأوساط نمو أجناس أخري مثل Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من الأخرى.
يلاحظ وجود مستعمرات خضراء لامعة وذلك بسبب methylene blue الذي في الوسط نتيجة للتخمر الناتج من حمض اللاكتوز وهي مستعمرات صغيرة عير لزجة ومسطحه وتمثل سـلالة E. coli .
يشاهد وجود مستعمرات شفافة سوداء في المنتصف وهي مستعمرات مخاطية و لزجة جدا وأخري لزجة قليلا تشبه عين السمكة في شكلها وهي مخمرة للاكتوز وتمثل في أغلب الأحيان سلالة Klebsiella and Enterobacter
.
يشاهد وجود مستعمرات فاتحة اللون وغير مخمرة للاكتوز تميل الي الأزرق وتتلألأ يشتم منها رائحة الحلوى.
ويتم بعد ذلك التأكد من E. coli بالاختبارات البيوكيميائية مثل أختبار IMViC
I =Indol
M= Methyl red
V = Voges Proskauer
C = Citrate
وهو عبارة عم مجموعة أختبارات مشتركه تجري معا والتي يتم تناولها في شئ من التفصيل في الجزء الخاص بها .
و أجناس أخري مثل Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من الأخرى.
4. بكتريا الـSalmonella :
هي بكتريا ممرضة للإنسان والحيوان تدخل عن طريق الفم ( Oral Route) وتنتقل للإنسان عن طريق الحيوان والمنتجات الحيوانية ( لحوم حمراء ، دواجن ، أسماك الخ …) وتسبب الالتهاب المعوي والإصابات الجهازية والحمي المعوية (Enteric Fever)
تنمو السالمونيلا في الأوساط البسيطة ولكنه إطلاقا ُ لا تخمر اللاكتوز أو السكروز، تكون الحامض وأحيانا الغاز عند تخميرها الجلوكوز أو المانوز وعادة تنتج غاز كبريتيد الأيدروجين
( H2 S) الذي يشبة رائحة البيض الفاسد ويمكن للسالمونيلا العيش في الماء المجمد لفترات طويلة وهي كذلك مقاومة لبعض الكيمياويات مثل ٍSodium brilliant green ,
, Sodium teterathionate Deoxchococlate ولذلك يمكن إضافة هذه الكيماويات للأوساط المزرعية عند عزل السالمونيلا.
طريقة التحليل :
- يتم أضافة 25 جرام من العينةفي وسط Lactose Broth أو وسط Buffer peptone waterلمدة 24 ساعة في درجة حرارة 37 مئوية.
- يتم نقل 10مل من وسط Bpwأو LBالي 90 مل الي وسط Rappaport-Vassilidis ويحضن الي 24 ساعة في درجة حرارة 37 مئوية.
- يتم نقل 10مل من الوسط السابق الي وسط broth teterathionateأو- Selenite cysteine broth ويحضن لمدة 24 ساعة في درجة حرارة 37 مئوية.
- يتم التزريع في أوساط مثل ,SSA ,XLD ,HE, DCL, BS وهي أوساط تفريقية اختيارية (Differential & Selective ) لعائلة المعويات صبغة سالبة جرام ومثبطة لمعظم البكتريا موجبة صبغة جرام وتميز بين البكتريا المخمرة للاكتوز والغير مخمرة للاكتوز.وأما السالمونيلا فيتم توضيح خصائص النمو وتميزها عن غيرها في النقاط القادمة موضحة بالصور لتعميق الفهم .
- تعطي السالمونيلا مستعمرة حمراء اللون لون وسوداء في الوسط وهذا السواد ناتج من غاز H2 S الناتج من مخلفات البكتريا وهو السبب لإعطاء هذا اللون في مختلف الأوساط.
في وسط XLD تنمو مجموعة من المعويات ويمكن التمييز بينها أوليا بالشكل الظاهري للمستعمرة وذلك لأن البكتريا المخمرة للاكتوز تعطي اللون الأصفر والغير l dir=RTL style=‘margin-right:54.0pt;text-align:justify; text-indent:-18.0pt;mso-list:l0 level1 lfo1;tab-stops:list 54.0pt;direction: rtl;unicode-bidi:embed’>وهو عبارة عم مجموعة أختبارات مشتركه تجري معا والتي يتم تناولها في شئ من التفصيل في الجزء الخاص بها .
و أجناس أخري مثل Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من الأخرى.
-
مخمرة تعطي اللون الأحمر أو الوردي ولكن هذا غير كافيا للتأكد من نوع الميكروب .
-
القيام بالاختبارات البيوكيميائية للتعرف علي السالمونيلا.
الأوساط التفريقية والاختيارية Differential & Selective media
XLD Agar Xylose Lysine Desocholate (1) :
يقوم هذا الوسط بتثبيط نمو البكتريا موجبة صبغة جرام وتسمح بنمو البكتريا سالبة صبغة جرام ومن مكونات هذا الوسط amino acid L-lysine, sodium thiothsulfate, phenol red ويستخدم الفينول الأحمر كمؤشر Indicator تكشف عن البكتريا المخمرة للاكتوز أو السكروز عن طريق التخمر الناتج من الحمض الأميني amino acid L-lysine ويعطي اللون الأصفر واذا كانت البكتريا غير مخمرة للاكتوز أو السكروزLactose or sucrose not ferments فهي تعطي اللون الأحمر دلاله علي عدم التخمر.
في بعض الأحيان تكون هنالك مستعمرات سوداء اللون وهي ناتجة من تفاعل thiothsulfate ونعرض لخصائص المستعمرات النامية علي XLD في توضيح اللون.
E.coli : flat yellow colonies تعطي مستعمرات مسطحه صفراء اللون
Enterobacter & Klebsiella : mucoid yellow colonies مستعمرات صفراء مخاطية
Proteus : مستعمرات حمراء الي صفراء وتعطي لون أسود في الوسط
Salmonella :عادة تعطي اللون الأحمر مع لون أسود في الوسط
Shigella مستعمرات وردية الي حمراء اللون :
في حال وجود المستعمرات ذات اللون الأسود فيجب التأكد بالاختبارات البيوكيميائية لتشابه Salmonella و Proteus
(2) Hekton Enteric Agar(HE)
يقوم هذا الوسط بعزل بكتريا Salmonella و Shigella وبعض بكتريا سالبة صبغة جرام
وتوضيح الخصائص كالتالي :
Salmonella & Proteus مستعمرات زرقاء الي خضراء اللون مع وجود سواد في الوسط :
مستعمرات خضراء اللون رطبة( Moist) ومرتفعه قليلا : Shigella
Coliforms : Salmon- pink to Orange برتقالي الي وردي اللون -
العد الكلي للفطريات والخمائر Mould & Yeast Count
لا يخفي علينا الدور الذي تلعبه بعض الفطريات والخمائر في الكثير من الصناعات حيث هنالك بعض أنواع من الفطريات مثل الفطر Penicillium roquefoti الذي ينمو علي سطح الجبن مكسبا إياها صفاتها المميزة ومثل الخميرة التي تستخدم في صناعه الخبز ومن ناحية أخرى فبعض الفطريات والخمائر تسبب المتاعب الصناعية في صناعة الألبان ومنتجاتها حيث تقوم بتغيير قوامها الطبيعي ومنتجات أخري عديدة.
طريقة التحليل : -
يتم التزريع بنقل 0.1 مل من التخفيفات السابقة علي كل طبق من الأطباق المجهزة بوسط التزريع Malt Exert agar وهو وسط يمكن أن تنمو فيه الفطريات والخمائر والذي أضيف إليه مضاد حيوي (Antibiotic) لمنع نمو البكتريا.
-
تحضن في درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة .
-
يتم حساب الخمائر أو الفطريات النامية ثم الضرب في مقلوب التخفيف .
-
في منتج خميرة الخباز قد تختلف الحسابات قليلا فيتم عد الخميرة النامية علي الوسط حتى التخفيف التاسع فأكثر وذلك يدل علي جودة الخميرة وإنتاجها ونشاطها.
-
يتم إضافة المضاد الحيوي بعد التعقيم وبعد أن تصل درجة الوسط الي 45 درجة.
-
بكتريا الكلوستدرديوم بيرفرنجس Clostridium perferngnes
بكتريا Clostridium perferngnes موجبة لصبغة جرام وتحتوي علي غلاف(Capsule ) وهي لا هوائية لذي تنمي في جو منعدم من الأوكسجين وهي من البكتريا التي تسبب بالتسمم الغذائي ويتم الكشف عنها في العديد من المنتجات المختلفة.
طريقة التحليل : -
يتم نقل 1.0 مل من التخفيفات السابقة الي طبق بتري و يضاف الوسط Agar perferngnes
-
توضع الأطباق في مرطمان لاحيهوائي An aerobic jar ويتم ضبط درجة الحرارة والتأكد من طرد الهواء منه.
-
تتم قراءة النتيجة بعد 48 ساعة.
span lang=AR-SA style=‘font-size:14.0pt;font-family:“Simplified Arabic”’>
و أجناس أخري مثل Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من الأخرى. -
يشاهد مستعمرات شديدة السواد ورائحة H2 S الكريهة.
-
يتم حساب نمو المستعمرات علي المزرعة ومقارنتها مع الحدود الميكروبيولوجية السودانية.
-
بكتريا Staphylococcus aureus
أفـراد هـذا الجنس كروية موجبة لصبغة جرام وهي ذات شكل عنقودي ليس لهـا بوغيــات (Non spores) يوجد منها حوالي 32 نوع وهي هوائية أو لا هوائية قي وجود بعض الكربوهيدرات الممكن تخميرها ومن أهم أنواع الـ Staph Staphylococcus aureus
لدي هذا النوع العديد من الأنزيمات والسموم التي يفرزها وتسبب الإمراضيه ومثال لذلك
إنزيم Coagulase الذي يعمل تخثر بلازما الدم
السموم المعوية
إنزيم Fibroin lysine
إنزيم Penicillinase
إنزيم Lipase
وأما عن الإمراضيه التي يحدثها هذا النوع فيسبب التسمم الغذائي والتهاب الأوعية الدموية وتفرز أفراد aureus S. بعض السموم التي تقاوم درجة الحرارة المستخدمة عادة في البسترة وحقيقة تناول مثل هذا السم غير مميت عادة إلا أن تناوله يصحبه بعض الأعراض ض كالقئ والإسهال والآم في الظهر ولا تستمر هذه الأعراض أكثر من يوم واحد.
طريقة التحليل :
من التخفيفات التسلسلية يتم التزريع بطريقة Spread plate count وهي نشر 0.5 مل علي وسط Baird parker الذي أضيف إليه بعدعقيم وعند درجه 45-50C يضاف 10 مل من صفار البيض egg yolk emulsion وإضافة Supplement لمنع نمو لأجناس الغير مرغوب فيها -
يتم التحضين لمدة 48 ساعة في درجة 37C ومن تم التعرف علي الخصائص المورفولوجية للمستعمرة .
-
يتم التعرف علي مستعمرات رمادية الي سوداء grey-black ومنطقة واضحة a clear zone وذات لمعان يتم تحويلها الي وسط Brain heart infusion (BHI) broth
يتم التأكد منها باختبار بلازما الدمtest Coagulase -
يوجد العديد من الاختبارات التي يمكن الكشف عن S. aureus بواسطة الفحص الـ Kits متخصص في ذلك.
8.بكتريا الليستريا مونوسايتوجنس Listeria monocytognes
تسبب تسمم الأغذية والتلوث وهي من أخطر أنواع الليستريا حيث تسبب الكثير من المشاكل الصحية للنساء الحوامل التي قد تسبب لهم الإجهاض والأطفال حديثي الولادة وكبار السن لأن جهاز المناعة لديهم ضعيف The disease affects primarily pregnant women, newborns, and adults with weakened immune systems.
ومن الأعراض التي تعتري المريض المصاب بها هي الحمي الشديدة والقئ والإسهال المتكرر والشعور بالصداع والآم في العنق والتهابات الدم، وفي الولايات المتحدة أصيب حوالي 2500 شخص توفي منهم 500 مريض بهذه البكتريا منهم شيوخ وأطفال حديثي الولادة ونساء في مراحل الحمل المختلفة .
توجد الليستريا في العديد من الأطعمة أهمها منتجات الألبان حيث يكون مصدرها الأبقار المصابة بمرض listeriosisوالتي بدورها تنقل البكتريا المسببة لهذا المرض وأكل الخضروات دون طهيا جيدا.
الأوساط المطلوبة :
يوجد هناك الكثير من الأوساط التي تساعد في عزل ونمو هذه البكتريا ويستخدم أيضاً الاختبارات السريولوجية والبيوكيميايئة لذا نحن في المختبر نستخدم المتوفر منها وحسب المتطلبات التي تفرضها الإمكانيات . -
PALCAM agar (M118a)
-
Carageenan (Sigma type II)
-
BCM agar (M17a)
-
MOX agar (M103a)
-
ALOA agar (M10a)
-
Chromogenic Listeria Agar (M40b)
-
Rapid L’mono (M131a)
-
CHROMagar Listeria (M40a)
-
Tryptose broth and agar (Difco) (M167
-
Oxford medium (OXA) (M118)
Physiological saline solution, 0.85% (R63)
Listeria Selective Agar& broth
CAMP test
:l1 level1 lfo2;tab-stops:right 9.0pt list 18.0pt; direction:rtl;unicode-bidi:embed’>3. تتم قراءة النتيجة بعد 48 ساعة.
span lang=AR-SA style=‘font-size:14.0pt;font-family:“Simplified Arabic”’>
و أجناس أخري مثل Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من الأخرى.
طريقة التحليل :
- أضافه Supplement بعد أن يصل الوسط الي درجة حرارة 45-50 درجة مئوية لمنع نمو الأنواع الأخرى .
- نقل 10 مل من التخفيفات الي وسط enrichment مثل Listeria broth ويحضن في درجة 30 لمدة 24 ساعة.
- التزريع في وسط Listeria Agar أو PALCAM agar أو Oxford medium .
- تسجل النتائج وملاحظة نمو المستعمرات صغيرة الحجم بنية اللون وذات خافية سوداء اللون .
- مشاهدة البكتريا بالمجهر الضوئي لملاحظة الشكل الخاص بـ Listeria monocytognes.
- تجري الاختبارات البيوكيميائية للتأكد من جنس Listeria monocytognes
للتعرف علي المزيد من الخصائص المورفولوجية والاختبارات وأوساط الأخرى الرجوع الي ملف Listeria monocytognes في القرص المدمج.
9.بكتريا الغلال Bacillus cereus
موجبة صبغة جرام وهي هوائيا اختياريا و ذات أبواغ facultative aerobic spore former وهي عصوية الشكل ,وأغلب الأنواع متحركة. وهي تتسبب في تسمم الأطعمة food poisoning وينتج عن ذلك إسهالا شبيه بالذي تسببه بكتريا Clostridium perfringens
حيث يحدث تشنجا وتقلص في منطقة البطن ويصحب ذلك ألآم شديدة والشعور بالغثيان بعد 6-15 ساعة استهلاك الطعام الملوث بالبكتريا Bacillus cereus.
وجود أعداد كبيرة منها 104 فأكثر فهذا مثيرا للتحفظ علي المعاملة أو الطريقة التي أنتج بها ذلك المنتج وذلك يرسخ أن الميكروب في زيادة مطردة. ومن الأطعمة التي يتضمن وجوده فيها اللحوم واللبن والخضروات والأسماك (including meats, milk, vegetables, and fish ) وكذلك والنشويات مثل البطاطس والأرز والجبن المصنعة .
الأوساط والمحاليل media and reagents :
هنالك العديد من المتطلبات للكشف عن هذة البكتريا وهي حسب الترتيب كالتالي : - Nutrient agar for B. cereus.
- Trypticase soy-polymyxin broth.
- Mannitol-egg yolk-polymyxin.
- Motility medium (B. cereus).
- Voges-Proskauer test reagents.
e=‘mso-spacerun:yes’> a clear zone وذات لمعان يتم تحويلها الي وسط Brain heart infusion (BHI) broth
يتم التأكد منها باختبار بلازما الدمtest Coagulase - Gram stain reagents.
طريقة التحليل :method : Analysis
- تحضير العينة Sample preparation :
يوزن 50 جرام من العينة تضاف الي 450 مل من الوسط المخفف peptone water وإجراء التخفيف التسلسلي المعروف. - عد الأطباق: plate count of B.cereuse
يتم نقل 0.1 مل بواسطة الماصة الي الأطباق ومن ثم نشرها علي الوسط MYP agar بواسطة قضيب زجاجي معقم sterile glass spreading rodوتحضن لمدة 24 ساعة في درجة حرارة 30 درجة مئوية.
يلاحظ نمو مستعمرات تحيط بها منطقة شفافة أذا B. cereus تقوم بعمل Zone حول نفسها وهي عادة تعطي لون وردي. وبعدها يجب القيام بعد المستعمرات النامية. - وهي طريقة أخري للكشف عن هذه البكتريا وهي بتعريض أنبوب يحوي وسط مغذي سائل وتنقل إليه بالماصة 1.0 مل من العينة الي حرارة عالية بواسطة الحمام المائي في درجة 80°C ومن ثم يعرض الأنبوب الي درجة برودة مفاجئة وذلك للتخلص من الأنوية الخضرية أو الابواغ Spores للبكتريا والذي تسبب تغير الحرارة المفاجئ في تحطيمها ومن ثم تزرع في وسط Nutrient agar في درجة 55°C لمدة 24 ساعة والصورة التالية تظهر نموئها في وسط مغذي.
:rtl;unicode-bidi:embed’>3. تتم قراءة النتيجة بعد 48 ساعة.
span lang=AR-SA style=‘font-size:14.0pt;font-family:“Simplified Arabic”’>
و أجناس أخري مثل Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من الأخرى.
بكتريا الكوليرا Vibrio parahaemolyticus
يوجد هذا النوع من البكتريا في من الأطعمة وخصوصا في القشريات والأسماك والعديد من الأصداف البحرية التي يتم تناولها مباشرة وتسبب البكتريا الإسهال الشديد والمتواصل مما يفقد المصاب بفقدان حاد في السوائل وبالتالي الوفاة وكما تسبب تحلل في كريات الدم الحمراء وأوجاع ومقص حاد وارتفاع في درجة حرارة الجسم .
طريقة التحليل :
- يتم التزريع في وسط ALKALINE PEPTONE WATERلمدة 6 ساعات ويحضن في درجة 37 والوسط المستخدم عبارة عن وسط يساعد في تنشيط وأنماء الكوليرا وذات قاعدية عالية ph 8.4 وهو يختلف عن البيبتون العادي.
- يتم التخطيط في وسط TCBS AGAR (Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose Agar) والتحضين في درجة 37 لمدة 24 ساعة.
وسط TCBS AGAR وتظهر فيه Vibrio parahaemolyticus باللون الأخضر.
[/SIZE][/COLOR]