تحليل اغذية (ميكروبيولجي صبغة جرام )


(جمال الدين عبد العظيم) #1

صبغة جرام

[COLOR=“Blue”][SIZE=“4”]وهى من الصبغات المركبة التفريقية وهى من أهم وأكثر طرق الصبغ استعمالا وبإستخدام هذا النوع من الصباغة تنقسم البكتريا إلى قسمين:
موجبة الجرام وسالبة الجرام
ويعود الاختلاف في الصبغ لهذه الإنواع من البكتريا إلى الإختلافات الموجودة في الطبيعة وتركيب الطبقات السطحية وتحتاج صبغة جرام الى أربعة محاليل مختلفة:-
1)صبغة قاعدية
2)مرسخ
3)عامل مزيل للون
4)صبغة مضادة (الصبغه الثانية)

فالمرسخ عبارة عن مادة تزيد القابيلية أو الجذب بين الخلية والصبغة أي أنها تساعد على ترسيب الصبغة وتثبيتها على سطح الخلية ومثل هذه المرسخات اليود حيث بإستعمال هذه المرسخات فإن الخلية تصبغ بقوة ويصعب إزالة الصبغة منها
والعامل المزيل للون عبارة عن ماده تزيل الصبغة من الخلية المصبوغة حيث أن في صبغة جرام التفرقة بين أنواع البكتريا تعود إلى الاختلافات في سرعة إزالة الصبغة بين تلك الأنواع
الصبغة المضادة:صبغة قاعدية تختلف في لونها عن لون الصبغة الأساسية المستعملة والغرض من استعمال الصبغة الثانية (الصبغة المضادة) هو إعطاء الخلايا لونا يختلف عن لون الصبغة الأساسية وعلى ذلك فإن الخلايا التي لم تزل منها الصبغة الأساسية تحتفظ بلون الصبغة الاساسية أما الخلايا التي أزيلت منها الصبغة الاساسية فأنها تأخذ لون الصبغة المضادة

ملخص الطريقة:
تتضمن المرحلة الاولى صبغ الخلايا بالصبغة القاعدية الاساسية ثم معاملتها بمرسخ ثم معاملتها بعامل مزيل للون مثل الكحول فالخلايا التي تحتفظ بالصبغة الأساسية عقب أستعمال مزيل اللون تسمى موجبة الجرام والخلايا التي زالت منها الصبغة الاساسية وأكتسبت لون الصبعة المضاده تعرف بسالبة الجرام

الطريقة:-
1)Make a smear then let it dry and fixed it into fire
2)Flood slide with crystal violet for 1 min
3)Wash with water
4)Flood with grams iodine for 1 min
5)Wash with water
6)Put alcohol for 10 sec
7)Wash with water
8)Consetrate with safranin for 1 min
9)Wash with water then let it dry
10)Put it under microscope

ونلاحظ أن صبغة جرام تقسم البكتريا على أساس الفروق الموجودة فى طبيعة جدارها الخلوى فنجد أن الجدار الموجب الجرام في البكتريا يتكون من طبقة سميكة من الببتدوجلايكان
ونجد ان الجدار السالب الجرام يتركب من عدة طبقات رقيقة من الببتدوجلايكان محاطا بطبقات خارجية من البروتين واللبيدات وعديدة السكريات والاختلاف بين نوعي البكتريا في درجة النفاذية للتركيبات السطحية
[/size][/color]
صبغة الجرام بالخطوات
http://www.mediafire.com/?vn1i1m9ao9yb9ay
صباغة البكتيريا ب Gram stain

[COLOR=“Blue”][SIZE=“4”]1- حضر المواد اللازمة للصباغة
(distilled-water / Iodine / crystal violet / alcohol aceton solution / Safranin / normal saline / wire loop /slid / لهب بنزن / حوض للصباغة )

2- عمل مسحة بكتيرية باتباع ما يلي :
أحضر slide نظبف واكتب علية اسم المريض على طرفة ، وفي منتصف slide ضع قطرة من Normal-saline
حرق wire loop (تعقيمة) وذلك بابقائة على اللهب حتى يحمر
بجانب لهب بنزن افتح طبق بتري المحتوي على البكتيريا المطلوب صباغتها واغرس wire loop في ال Agar بمنطقة لاتحتوي على نمو بكتيري ثم ارفعة
قم باخذ 2-3 bacteria colony وضعهم على قطرة Normal-saline وامزجهم جيدا mix ستلاحظ تعكر Normal-saline

احرق wire loop مرة اخرى واعدة لمكانة واترك المسحة لتجف في الهواء
تحذير لا يجوز استخدام الحرارة لتجفيف المسحة لان ذلك يشوة الخلايا المتواجدة
اجراء عملية التثبيت Fixation للبكتيريا بواسطة لهب بنزن (الحرارة) وذلك بتمرير slide المحتوي على المسحة فوق اللهب من4 الى 5 مرات . ان هذة العملية تساعد على تغيير طبيعة الانزيمات المحللة وذلك بمنع التحلل الذاتي للبكتيريا وكذلك الحرارة تعمل على زيادة الالتصاق الخلايا بالشريحة وعدم اجراء هذة الخطوة يعني خسارة البكتيريا المتواجدة على slide مع اول غسلة لها (وطبعا تكون المسحة البكتيرية من الاعلى وليسة من جهة اللهب)
3- عملية الصباغة :
ضع slide المحتوي على المسحة البكتيرية المطلوب صباغتة على حوض الصباغة(وطبعا الجهة المحتوية على المسحة تكون للاعلى )
اولا : اغمر الشريحة بCreystal violet ذو اللون البنفسجي واتركه لمدة دقيقة واحدة ثم تشطف الشريحة slide بالماء المقطر distilled water وذلك للتخلص من الصبغة الزائدة
ثانياً: اغمر الشرحة ب iodine ذو اللون الأصفر واتركه لمدة دقيقة ثم يشطف بالماء
ثالثا: اغمر الشريحة ب alcohol acetone solution المحضر بنسبة 1:1 ذو اللون الشفاف المستخدم لاستخلاص الصبغة decolorizer وتترك لمدة 30 ثانية ثم تشطف بالماء المقطر
تحذير: إذا زادة المدة عن 30 ثانية سوف يؤدي ذلك لظهور نتائج متغايرة وتحديدا سؤدي ذلك لتحول g+ve إلى g-ve
رابعاً: تغمر الشريحة ب safranin ذو اللون الاحمر الغامق التي تستخدم كصبغة بديلة counter stain وتترك لمدة دقيقة ثم تشطف بالماء المقطر
جفف الشريحة المصبوغة باستخدام ال filter paper
تفحص الشريحة على العدسة الزيتية قوة تكبير 100
النتائج :

تصبغ باللون البنفسجي g+ve
تصبغ باللون الاحمر g-ve
[/size][/color]
العصويات الموجبة لصبغة جرام

Clostridium
ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــ
وتنقسم هذه المجموعة الى عائلتين:-
1)المجموعة الغازية:وتشمل عصويات ولنشي وعصوياتPerfrenges والتي تمتاز بقدرتها على غزو الانسجة الداخلية وتكوين غازات كثيفة ذات رائحة كريهه مما يؤدي الى تعفن العضو المصاب والتورم والغرغرينا وهى تفرز سموما خارجية قليلة النشاط
2)المجموعة غير الغازية:وتشمل عصيات الكزاز وعصيات التسمم وتمتاز بأفرازها سموما خارجية نشطة تسبب أنسماما للدم وهى لاتطلق غازات لانها لاتهاجم الانسجة
الصفات العامة:-
لاتستطيع العيش في جو هوائي لانها لاتفرز أنزيم الكتاليز الذي يتحد مع فوق أكسيد الهيدروجين لذا يعتبر الاكسجين ضارا لها لانه يتحد مع الماء الموجود في الخلية ويكون فوف أكسيد الهيدروجين الذي يتأين فيعطي الماء والاكسجين الذي يؤكسد الخلية البكتيرية بينما البكتريا الهوائية تحلل فوق أكسيد الهيدروجين بفعل أنزيم الكتاليز الى ماء وجزئ أكسجين غير ضار بها
وهى عصيات موجبة الجرام ولها أبواغ وهى رفيعة مستقيمة الشكل تفرز سموما خارجية وتتواجد في التربة لاحتواها على أبواغ
وهناك أنواع من Clostridium تعتبر سامة وممرضة منها:-
1)Clostridium tetani : causing tetanus
2)Clostridium perfringes : causing gas gangrene
3)Clostridium botulinum : causing food poisoning

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــ
Clostridium Botulinum

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــ
كما ذكرت فأن هذه البكتريا تسبب تسمم الغذاء بسبب أفرازها سموما خارجية وتسبب شللا في عضلات الامعاء والبلعوم والمرئ
أعراض هذا التسمم:-
1)الغثيان والتقيؤ
2)أزدواجية الرؤيا
3)سقوط الاهداب ووسع بؤبؤ العين
4)ألم في البطن
السموم المفرزة:-
تعتبر سموم هذه البكتريا أقوى السموم البكتيرية حيث يؤدي حقن كمية 0000033، الى قتل فئران التجارب خلال ثواني قليلة
وتقسم السموم الى
C-سام للطيور
D-سام للاغنام والابقار والخيول
G-أكتشف في الارجنتين
F-سميتة ضعيفة للانسان

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ـــــــــــــــ
Clostridium tetani

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــ
تسبب هذه العصيات مرض الكزاز الذي ينتج عن تلوث الجروح العميقة بالبكتريا حيث تنتقل الى الدم وتفرز سموما قوية تؤثر على الجهازين العصبي والعضلي
السموم المفرزة:-
1)سموما تحليلية:وهى تسبب تحللا لكريات الدم الحمراء
2)سموم عصبية:حيث تؤثر على الخلايا العصبية خاصة في أعصاب الرقبة والفكين وتسبب أنقباضات في الفكين وقد تؤدي الى الوفاه حيث قد يحدث تشنج في عضلات الجهاز التنفسي ويفقد المريض القدرة على التنفس

البكتريا الكروية السالبة لصبغة جرام

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ ـــــــــــــــ
النيسرياNesseria
[COLOR=“Blue”][SIZE=“4”]هناك نوعان اساسيان من نيسريا الامراض:-
أ-نيسريا السحائية Nisseria meningitidesوهى التي تسبب التهاب السحايا
ب-نيسريا السيلانيةNesseria gonorrheaتسبب السيلان

الصفات الشكلية:-
عبارة عن مكورات توجد على شكل ثنائي
ليس لها محفظة ولاابواغ
سالبة الغرام وغير متحركة

الصفات المزرعية:-
بكتريا هوائية درجة الحرارة المثلى لنموها 37 مئوية وتنمو على منابت الاجار ويزداد نموها بأضافة كريات الدم المتحللة أو مصل الدم وأفضل المنابت هو آجار الشوكولاته حيث تظهر المستعمرات صغيرة رمادية اللون أو لؤلؤية شفافة دائرية ويمكن أن تظهر حافتها منشارية بعد التحضين لمدة 24 ساعة.وتظهر تحت المجهر بشكل كلوى وتدعىG.I.N.D وهوGram negative interacellular diplococci
وتوجد هذه البكتريا في الاغشية المبطنة للقناة البولية للانسان والقناة الهضمية وقطرها يتراوح من 0،6 الى 1،0 ميكرون ومن مميزاتها انها تموت بسرعة في درجة حرارة الغرفة خارج جسم العائل
الصفات البيوكيميائية:-
النسيريا السحائية تخمر الجلوكوز والمالتوز بأنتاج حامض بدون غاز
بينما النسيريا السيلانية تخمر الجلوكوز فقط

القدرة الامراضية:-
1)التهاب السحايا:تسببه نيسريا السحايا وهى سامة جدا اذ تفرز سما واحدا ينتشر نتيجة للتحلل الذاتي السريع في الزراعة وتنتقل عن طريق الاوعية اللمفاوية او الدموية

الاعراض:يبدأ المرض بأرتفاع مفاجئ في درجة الى 39 الى 40 مئوية وصداع وغثيان وتصلب الرقبة

[/size][/color]

مكورات ثنائي السيلان:-
[COLOR=“Blue”][SIZE=“4”]وهى تسبب مرض السيلان وهو مرض جنسي معدي

الاعراض السريرية:عند المراة :نجد أن المراة هى التي تنقل المرض للرجل وقد لاتظهر عليها أعراض المرض وقد تظهر وهى:-
1)أفراز صديدى مهبلي شديد
2)التهاب الشفرين الصغيرين فيصبحان أحمران مؤلمين
3)قد يؤدي الالتهاب الى أنسداد البوقين وبالتالي العقم
عند الرجل:-
1)حرقة وألم في مجرى البول
2)أفراز صديدي من الاحليل
3)قد تحدث بعض المضاعفات اذا أهمل العلاج مثل تضييق الاحليل والتهاب البروستات
عند الاطفال حديثي الولادة
كما هو معروف أن الطفل حديث الولادة يمر من خلال المجرى التناسلي للام فأذا كانت مصابة فقد يصاب الوليد أثناء الولاده بالرمد الولادي لاحدى العينين أو كلاهما
[/size][/color]